2.4细菌16SrRNA分子鉴定

16S rRNA PCR产物电泳结果(图4)表明,罗氏离从细菌 菌株的DNA模板中扩增出大小约为1400 bp左右的片 段,符合预期结果,序列号为MN736843,将基因序列通过NCBI进行同源比对分析,结果显示与该序列同 源性比最高的菌株均是豚鼠气单胞菌，将序列与已知 序列构建系统发育树(图5),沼虾可以看出,该菌株与豚鼠气单胞菌(A. caviae)聚为一个分支,结合生化实验和革 兰氏染色等结果,可确定该分离菌株为豚鼠气单胞菌。

2.5人工感染

经过人工感染的罗氏沼虾出现与自然水域患病虾 相似的症状,感染罗氏沼虾出现鳃丝红肿,鳃丝表面出 现黑斑等症状(图6),感染组在7天内全部死亡，而对 照组没有出现异常。气单从人工感染濒临死亡的胞菌罗氏沼虾 肝胰腺组织内再次进行细菌分离纯化，将分离菌株再 次进行生理生化实验以及分子学鉴定等,分定得到与原分 离菌株相同的实验结果,证明该分离菌株为罗氏沼虾致病菌-豚鼠气单胞菌(A.caviae).

3讨论

豚鼠气单胞菌(A.caviae)隶属于气单胞菌科.气单 胞菌属，是罗氏离威胁中国水产养殖动物健康的主要致病菌之一,能够导致日本鰻鲡(Anguillajaponica).胡子鲶(Clarias fuscus).中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis). 中国 对虾(Penaeus chinensis). 南方鲇(Silurus meriordinalis Chen)、中华鳖(Triongxsinensis)等多种水产动物感染。沼虾本次研究从患病的豚鼠罗氏沼虾体内分离出致病 菌，井将得到的气单优势菌株通过细菌形态观察.革兰氏染 色、溶血试验以及生理生化分析可初步判断该分离菌 株为豚鼠气单胞菌(A. caniae).其16S rRNA基因序列 构建进化树,胞菌结果显示该分离菌株与豚鼠气单胞菌聚 为一族,综合所有实验结果可确定该分离菌株为豚鼠 气单胞菌。使用该分离菌株对健康罗氏沼虾进行人工 感染.感染后的分定罗氏沼虾表现出与自然水城条件下患 病虾相似的症状,并对感染后的罗氏沼虾再次进行细 菌分高纯化.得到与豚鼠气单胞菌相似的菌株,进一一步: 证明了该细菌在罗氏沼虾体内的致病性,同时也对豚 鼠气单胞菌的病原研究资料进行了一定的补充。

对分离菌株的生理生化特性进行鉴定,该病原菌 对氧化酶、阿拉伯糖、沼虾葡萄糖产酸、豚鼠蛋白胨水.精氨酸水 解酶、明胶.苯丙氨酸为阳性:硫化氢.丙二酸盐.赖氨 酸脱发酶。鸟氨酸脱羧酶。枸缘酸盐.V-P .葡萄糖酸盐 为阴性,豚鼠气单胞菌的生理生化特性存在菌株差异 性，本研究分高的豚鼠气单胞菌对枸橼酸盐和蛋白胨 水的鉴定结果与模式气单胞菌相反,出现上述差异的 原因可能是由于养殖环境、气候条件.地理位置.寄主 体不同造成的。目前.,在水产动物中普遍使用抗菌药 物对疾病进行防治，本次研究的药敏实验结果表明,该 分离菌株对头孢曲松.氣霉素、氟苯尼考四环素、多西 环素s种药物高度敏感,对卡那霉素1种药物中度敏 感.对环丙沙星。诺氟沙星、红霉素.阿奇霉素新生霉 素.链霉素.复方新诺明和利福平8种药物耐药。本次 研究结果与已报道的其他品种分高出的脉鼠气单胞菌 的药物敏感性存在一-定差异1,这表明豚鼠气单胞菌 对药物敏感性存在一-定的差异,这可能和不同的地区。 不同养殖环境中药物种类以及药物使用程度不同有关于细菌的鉴定方法有很多,例如环介导等温扩 增技术.单克隆抗体和间接ELISA法等.16SrRNA在 细菌染色体的基因组中普遍存在,含高度保守区城且 分子大小始终。基于I6SrRNA基因序列分析具有简 易、高效等优点，已经成为细菌鉴定以及亲缘关系判断 的一一种有效的工具,但是因为I6SrRNA可能存在一一些 不清晰的位点且基因数目有限,所以给序列的分析带 来不便，本次研究对分离细菌的16SrRNA基因及其系 统进化树进行分析,并与生理生化特性和革兰氏染色 等方法相结合,进而判断该分离菌株为脉鼠气单胞菌， 提高了细菌鉴定结果的准确性和可信度。

目前，已鉴定的气单胞菌属主要分离自人和不同 的动物寄主:从患病水生动物以及人感染的伤口中分离-有的还能在食物中分离纯化得到PPABLOS等 从腹泻病患.饮水以及食品分离的气单型菌进行鉴定﹐ 结果表明,人源气单胞菌和饮水源气单型菌较为接近， 说明气单型菌可以通过水源传播到人类,从而导致人 癸产生疾病P樊海平等*从发生败血症的中国对虾 分离纯化出豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌,但是关于 从罗氏沼虾中分离到豚鼠气单胞菌以及以豚鼠气单胞 菌感染为主的罗氏沼虾疾病的报道较少,罗氏沼虾豚 鼠气单胞菌是否能够导致人和其他水生动物发病﹐它 和人源气单胞菌有无亲缘关系,以及其致病机理均有 特进一步研究。因此,后期还需要进一步进行该病璧 菌的流行病学调查，了解其发病的规律,并确认其危害 的对象以及研究其致胸机理等,将更有利于对该致病 菌引起的罗氏沼虾疾病进行有效的防控,促进罗氏沼 虾产业的健康发展-

抗生素等药物是保持水产养殖业动物健康生产以 及病 例治的重要途径。可是由于当前水产市场抗生 素种类太多,以及用药习惯不一样，导政渔药使用相对 混乱,细菌的耐药现象也越来越严重,所以在水产动物 中对抗生素药物的选择和使用一定要有科学性,对病 瓯菌揉使用抗生素等药物治疗,必须参考其药敏实验 结果,严格遵循水产药物使用的相关规定﹐同时还要注 愈穿梭用药以及药物使用浓度.尽量避免药物的残留， 本次研究为罗氏沼虾豚鼠气单厩菌鉴定以及病害劭治 提供一定的参考和理论基础-

4结论

本研究从患病的罗氏沼虾中分离出一糅致病菌- 豚鼠气单胞菌,并通过对其菌落形态特征.生理生化鉴 定并结合16SrRNA序列分析,可判断该致病菌为豚鼠 气单慰菌.人工感染实验证实了该致病菌对罗氏沼虾 具有较强的致病性.药敏试验结果表明该致病菌对头 泡曲松.氯霉素.氟苯尼考.四环素.多西环素5种药物 高度敏感,而对环丙沙星.诺氟沙星.红霉素.阿奇霉 素.新生霉素链霉素.复方新诺明和利福平8种药物 耐药,因此可参考药敏试验结果对罗氏沼虾豚鼠气单 巍菌使用合适的药物进行治疗﹐以达到最佳治疗效 果-水研究所选的环丙沙星和氯霉素仅用来研究菌棵 的抗药性，并不能用于生产,面氟苯尼考可以作为罗氏 沼虾豚鼠气单脱菌的主要治疗药物。这也握醒养殖户 和研究生产人员在罗氏沼虾养殖过程中,要在国家觉 许药物使用范围之内,选取最佳眩感药物用来进行病 害防治,提高用药的针对性，做到合理慎重用药,尽量 减少药物残留.o研笼为进一步探讨罗氏沼虾豚鼠气 单胞菌的鉴定和防治提供一定的参考.

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